МИКРООРГАНИЗМЫ
Спасибо нашим инвесторам из казино онлайн
Культивирование простейших микроорганизмов
Практически культивирование простейших по сравнению с другими микроорганизмами играет лишь незначительную роль благодаря несовершенству методики. Значительные успехи, относящиеся главным образом к кишечным простейшим, получены лишь за последние годы. При наличии в исходном материале других микроорганизмов культивирование, особенно получение чистых культур, затрудняется сравнительно малой скоростью размножения простейших, которые заглушаются микроорганизмами с большей энергией роста. Трудность или легкость получения культур тех или иных простейших стоит в связи со способом их питания. Легче всего культивируются простейшие, питающиеся осмотическим путем, а при питании оформленной пищей – питающиеся бактериями или эритроцитами. Чистые культуры могут быть легко получены в тех случаях, когда материал для посева берется из стерильной среды; примером являются кровепаразиты, питательная среда для которых также может быть приготовлена стерильно. Простейшие, которые для своего роста нуждаются в неорганических или самых простых органических соединениях, тоже могут быть получены в чистых культурах. Там же, где в исходном материале простейшие находятся в смеси с другими микроорганизмами (кишечные, свободно живущие простейшие), получение чистых культур часто представляет непреодолимые трудности. Надо иметь в виду, что для не которых простейших бактерии являются необходимым питательным материалом. Очищение культур производится обычными в бактериологии методами. В случаях резкого количественного преобладания бактерий над простейшими в исходном материале, пользуются наклонностью некоторых простейших скопляться на поверхности пробирки с питательной средой, а также устойчивостью цист к высыханию: высушивание при 37° часто освобождает материал от бактерий. Для получения чистых линий производится посев изолированного индивидуума. Крупные простейшие легко изолируются под лупой при помощи пипетки. Для изолирования более мелких исследуемая жидкость разводится до тех пор, пока в одной капле будет не больше одного экземпляра. Из целого ряда покровных стекол с каплями под микроскопом отбираются и опускаются в питательную среду стекла с одним индивидуумом в капле (способ Lindner ‘а) или исследуемая жидкость набирается в очень тонкий капилляр; выбранная под микроскопом часть его с одним простейшим, наиболее удаленным от соседей, отделяется, и содержимое употребляется для засева (способ Oehler’a). (Возможно применение микроманипулятора.) При культивировании простейших иногда употребляется влажная камера или висячая капля (камера Шульца). – В зависимости от рода простейших применяются различные питательные среды: агар как таковой, агар с бульоном, с настоем сена, агар Нелера, кровяной, сывороточный, белково-яичная среда и т. д.
Что касается концентрации водородных ионов в питательных средах, то часть свободно живущих простейших переносит довольно широкие колебания (Bo-do edax – рН 4,8 – -9,6), у других границы уже, и особенно узки они у паразитических простейших. Сильное развитие бактерий в культурах быстро изменяет рН среды.
Свободно живущие простейшие в преобладающем большинстве культивируются легко. Многие свободно живущие амебы хорошо размножаются на простом агаре в смешанной культуре с бактериями. Рекомендуется способ Фроша и Мутона (Frosch, Mouton): чашка с агаром засевается подходящим видом бактерии радиальными штрихами, отступя от центра. В центральную часть чашки вносится материал, содержащий амебы, которые и размножаются по ходу бактериальной культуры. Свободно живущие жгутиковые частью выращиваются на среде Кноппа и на других минеральных средах; свободно живущие инфузории культивируются в смеси с бактериями. Особенное значение имеет культивирование паразитических простейших. С одной стороны оно является единственным диагностическим средством при скудном, недоступном для микроскопического исследования количестве возбудителей, с другой – предоставляет количественно достаточный материал для всестороннего изучения простейших. Культивирование паразитических простейших производится или на жидких средах или на твердых, которые при этом должны быть достаточно влажными. Содержание в среде животного или личного белка является обязательным.
При культивировании кишечных простейших всегда нужно иметь в виду простейших сапрофитов, цисты которых пассивно проходят кишечник вместе с пищей (Darmpassanten; амебы типа Limax, жгутиковые из рода Prowazekia и т. д.). В свежевыделенных faeces они выходят из цист; при посеве с целью выделения паразитических простейших вырастают и могут давать повод к диагностическим ошибкам. При кишечных катарах выхождение из цист может произойти уже в кишечнике (полупаразиты). Культивирование паразитических амеб сделалось обычным в лабораторной практике после введения Беком и Дрбо-лавом(Воеск, Drbohlaw; 1925) яично-белков. среды; свернутая смесь яичного белка и жидкости Локка покрывается в пробирках той же смесью, но жидкой. По американской терминологии обозначается Е. L. A. (Egg-Locke-Albumen). Твердая часть среды Бек-Дрбо-лава без ущерба для роста может быть заменена агаром с жидкостью Рингера (луч- ше с прибавлением 1 % крахмала) или NNN-агаром. По Крегу и Джону (Craig и John; 1927), еще лучший рост паразитических амеб получается на простой среде: человеческая сыворотка в смеси с жидкостью Рингера или физиологич. раствором. Посев для получения культур производится в предварительно нагретые пробирки петлей слизи из свежевыделенных faeces. Рост через 24 – 48 часов. Материал для просмотра берется капилярной пипеткой с поверхности твердой среды. Каждые 24 часа рекомендуется осторожно сменять жидкую часть среды, в которой обильно размножаются бактерии и бластоциты, придающие при своем росте кислую реакцию среде. В культуре амебы питаются бактериями, при прибавлении эритроцитов поглощают и их; иногда наблюдается образование цист. Культуры патогенны для молодых кошек (иногда даже вызывают образование у них печоночных абсцесов). Пересевы удаются легко в большом числе генераций. На среде Бек-Дрболава получены культуры следующих видов амеб: Ent. histolytica, Ent. coli (выращиваются труднее, чем Ent. histolytica), Entamoeba nana, Jodamoeba Biitschlii, Dientamoeba fragilis и Ent. gingivalis, а также Trichomonas vagi-nalis из жгутиковых. Из паразитических жгутиковых практическое значение для диагностики при отрицательной микроскопии имеет культивирование Trichomonas intesti-nalis. Хорошие результаты дает способ Рей-хенова (Reichenow) на среде из лошадиной (можно и другой) сыворотки и физиологического раствора. В пробирки засевают несколько см г кровянисто-слизистой части faeces. При 37° рост на 3-й день. Необходим пересев через 3 – 5 дней, иначе культура гибнет. При 25 – 30° длительность жизни культуры до 7 дней. Материал для исследования берется со дна пробирки. С менее верными результатами выращивается по способу Рейхенова Chilomastix Mesnili. Из кишечных инфузорий культивирование Balantidium coli производится или на человеческой сыворотке, смешанной с физиол. раствором (Barret, Yarbrough; 1921) (проверка по Дофлейну и Рейхенову не удалась) или на мясном бульоне с человеческой сывороткой, предварительно засеянной Вас. faecalis al-caligines (Reis; 1923). Рекомендуется прибавление к среде крахмала или др. углеводов. Культивирование жгутиковых простейших паразитов крови и тканей – лейшманий и трипаносом – производится на кровяных средах, гл. обр. на NNN-arape (в пробирках или чашках) или в бульоне с кровью. При культивировании на кровяных средах трипаносом рост их происходит в конденсационной воде NNN-arapa, на влажной поверхности чашек с NNN-агаром или в кровяном бульоне в верхнем слое эритроцитов. Кровь является безусловно необходимой частью среды. Агар повидимому обладает предохранительными функциями, связывая кровяные антитела, а может быть и продукты обмена простейших. Агар должен обладать достаточной плотностью, но содержать много воды, чтобы обусловить образование конденсационной жидкости. Лучше всего это достигается смешиванием 1 %- ного агара с дефибринированной кровью в равных частях. Однако для выращивания патогенных видов количество крови может быть доведено до 70%. Дорогостоящая кроличья кровь при выращивании некоторых видов трипаносом может быть заменена лошадиной. Конденсационная вода NNN-ara-ра и кровяной бульон благодаря присутствию кислых фосфорнокислых солей имеют рН – 5,6. Полезно прибавление к кровяным средам небольшого количества виноградного сахара, причем ему кроме питательной приписывается функция связывания некоторых ферментов. Засев производится несколькими каплями стерильно взятой, содержащей трипаносомы, крови. При введении большого количества крови действие находящихся в ней антител, а также образование кровяного сгустка, препятствуют росту. Ноллер (Noller) предложил культивирование трипаносом на чашках (агар с лошадиной кровью). Некоторые виды трипаносом дают характерные фигуры роста, позволяющие различать отдельные виды макроскопически. Соотношения, сходные с таковыми между лейшманиями и их культуральными формами – лептомонадами (см. ниже), наблюдаются также и между трипаносомами и кри-тидиями. В крови хозяина – форма трипаносом, в культурах – форма критидий. Оптимум роста для большинства трипаносом 28 – 30°. При 37° часто получаются дегенеративные вакуолизированные круглые лейш-маниоподобные формы, некоторые же трипаносомы сохраняют при этой t° трипаносом-ную форму (Trypanosoma theileri, Trypanosoma loxiae). Культуры трипаносом хладнокровных, птичьих, крысиных и рогатого скота (Tryp. theileri) получаются легко. Трудно культивируются все патогенные для животных и особенно для человека виды. Культуры возбудителей сонной б-ни, Тгур. gambiense и Trypanosoma rhodesiense, если и удаются, то только в первой генерации. Несколько легче культивируется Schizotry-panum cruzi. Культура лейшманий удается без особого труда. Материалом для посева является стерильно взятая кровь и пунктат из селезенки или – при восточной язве- – из не-вскрывшегося узла. Посев на NNN-arap производится в конденсационную воду. В культуре дня через два появляются жгутиковые формы Leptomonas, которые быстро размножаются продольным делением. Часто наблюдается образование розеток из сплетенных жгутиками особей. В старых культурах снова появляются безжгутиковые формы, долго сохраняющие жизнеспособность при пересевах. Культуры патогенны для животных. Оптимум роста 22°. Гл. обр. этот оптимум и отличает культуральные леп-томонады лейшманий от морфологически сходных с ними Leptomonas из кишечника совершенно безвредных насекомых. Последние растут медленнее при оптимуме роста около 30°. Методика посева Leptomonas насекомых такова. Вынутый по возможности стерильно кишечник насекомого много раз промывается в стерильном физиологич. растворе и раздавливается между стерильными предметным и покровным стеклами; полученная при этом жидкость набирается стерильным шприцем и засевается на пробирки или на чашки с ЗИ-агаром. Эта же техника употребляется и при посевах из кишечника насекомых, переносчиков три-панозомиазов и др.
О культивировании малярийного плазмодия – см. Малярия , паразитология. Культивирование спирохет. Широко применяемое за последние годы в лабораториях культивирование спирохет является достижением самого последнего времени, и здесь, особенно по отношению к некоторым видам, следует отметить переход от чрезвычайно сложных методов к самым простым. Необходимым условием культивирования спирохет является присутствие в среде белка (сыворотки, асцитич. жидкости и т. д.). Чаще употребляются жидкие среды, в которых при прочих равных условиях рост обильнее и подвижность более выражена, чем на твердых. Не являясь абсолютными анаэробами, спирохеты при выращивании все же требуют ограниченного доступа 0 2 , что достигается гл. обр. нанесением слоя парафинового или вазелинового масла на поверхность засеянной пробирки. Культивирование лептоспир возвратного тифа производится по способу Унгермана на полу свернутой разведенной раствором Рингера кроличьей сыворотке (преимущественно от молодых кроликов) или по способу Аристовского, а также Хата (На-ta)Ha лошадиной сыворотке, разведенной физиологическим раствором. Культивирование производится при 37° под слоем парафинового масла. Удаются многочисленные генерации. Культуры патогенны для человека. причем заражение может произойти пови-димому и через неповрежденные слизистые (доказано лабораторными заражениями). После пассажей через мышей или крыс патогенность для человека исчезает. – Культивирование возбудителя инфекционной желтухи – L eptos’pira icterogenes, а также водных лептоспир производится по способу Уленгута на водопроводной воде с прибавлением 30%-ной кроличьей сыворотки под слоем парафинового масла. При выращивании Leptospira icterogenes из крови Мантейфель с успехом применил способ Гильдемейстера .для диагностики брюшного тифа – посев 2 см 3 крови б-ного на 8 – 10 см 3 стерильной водопроводной воды. Необходимый для питания лептоспир белок они получают из засеянной крови. Оптимум роста – 25 – 30°. Вирулентность культур при пересевах падает, но может быть восстановлена несколькими пассажами через морских свинок . – Культивирование бледной спирохеты, возбудителя сифилиса, производится в условиях строгого анаэробиоза на различных средах: полусвернутая лошадиная сыворотка Шерешевского, сывороточный агар и бульон Мюленса, среда Шмамине, среда Ногуши, асцитический агар с кусочком стерильно взятой почки кролика и т. д. (optimum рН 7,2 – 7,8). Культуры получаются б. ч. в смеси с непатогенными спирохетами. Описанные чистые культуры Тгероп. pallidum не во всех случаях доказательны. В полутвердых средах бледная спирохета растет в виде скоплений, напоминающих облако, по уколу скопления располагаются четками. Морфологически бледные спирохеты из культур представляются более грубыми, чем в темном поле. По способу Гим-за они окрашиваются не в розовый, а в синеватый цвет. д. Муратова.
Вирусы, вызывающие в организме характерные клеточные включения; морфология не известна. – А. Болезни септического характера: 1) Agalaxie (агалактия овец и коз); 2) чума лошадей (virus Pferdepest, sud-afrikanische Pferdesterbe); 3) чума морских свинок (virus Meerschweinchenpest); 4) чума птиц (kyanolophia, pestis gallinarum); 5) ящур (febris aphthosa); 6) чума рогатого скота (virus Rinderpest); 7) чума свиней (cholera suum). – Б. Б-ни, поражающие кожу без сильных изменений ее: корь (morbil-Н), скарлатина (scarlatina). – В. Болезни, поражающие кожу и слизистые с сильными изменениями их: бородавки (verrucosis), бленорея (не гонококковая) (blenorrhoea) с включениями в эпителиальных клетках; varicella (ветряная оспа); variola (оспа); verruga peruviana, слизистая болезнь кроликов (Myxomkrankheit); trachoma (трахома). – Г. Вирусы, поражающие головн. мозг и спинной мозг: болезнь Борна (menin-goencephalitis epizootica); encephalitis le-thargica; herpes febrilis, lyssa (бешенство); чума собак (Hundestaupe). – Д. Вирусы, поражающие кровь – инфекционная анемия лошадей. Е. Бунина, В. Любарский. Культивирование микробов, аэробов и анаэробов – -разведение, выращивание микробов в искусственных лабораторных условиях, применяемое для изучения свойств микроба (выделенного из организма или другого материала) и определения его принадлежности к тому или другому виду. Культивирование микробов производится на искусственных питательных средах плотных и жидких, состав которых, а также и реакция должны быть приспособлены к свойствам данного микроба. Большинство патогенных микробов дает наилучший рост при t° тела (бацилы брюшного тифа, паратифов, дизентерии, холеры, гноеродные кокки и пр.), т. е. при 37°. Сапрофитные микробы дают хороший рост и при более низкой t°. Культивирование микробов производится в особых шкафах, термостатах (нагреваемых электричеством, газом или керосином), с постоянной t°, выравниваемой регуляторами, т. к. колебания t° вредно отзываются на росте микроорганизмов. Выращивание при более низкой t° может производиться вне термостатов при комнатной t°. Для изучения микроба и бактериол. его характеристики нуяшо его иметь в чистом виде, а не в смеси с др. бактериями, т. е. нужно получить его чистую культуру на искусственной питательной среде. Благодаря методу культивирования в лабораторных условиях имеется возможность постоянно располагать чистой разводкой того или другого микроба, что необходимо как для практических, так и научно-исследовательских целей. Для культивирования микробов (аэробов и анаэробов) пользуются приемами и методами частью общими для обеих групп микробов частью специальными. Питательные среды, употребляемые для выращивания микробов, разливаются в стеклянную бактериологич. посуду (пробирки, колбы, снабженные ватными пробками, и чашки). Все вместе тщательно стерилизуется. Методы культивирования аэробов. Аэробы выращиваются при хорошем доступе воздуха. Наиболее употребительны следующие питательные среды: мя-сопептонный» бульон, мясопептонный агар, желатина, пептонная вода, сахарные среды, картофель и другие среды.
Трипаносомоз
Трипаносомоз (б-нь Chagas’a в Бразилии) пересев культуры на жидкую или плотную среду производится (со времени Коха) при помощи платиновой петли, шпателя или прямой проволоки (посев уколом), вставленных в стеклянную палочку или специальные иглодержатели (рис. 1). Пробирки с перевиваемой культурой и незасеянная берутся в левую руку между большим и указательным пальцами, друг над другом, первая ниже, вторая над ней. Держат их почти в горизонтальном положении во избежание попадания внутрь пробирок микробов из воздуха при дальнейших манипуляциях. Правой рукой берут ручку платиновой петли, вынимают из пробирок ватные пробки, причем захватывают одну пробку мизинцем, прижимая к ладони, а другую между мизинцем и 4-м пальцем, обжигают на пламени горелки края пробирок, прокаливают петлю, вводят ее в засеянную пробирку, охлаждают о стенку, забирают петлей немного материала, переносят его в незасеянную пробирку и разбалтывают его в жидкой среде, растирая петлей о стенку пробирки. После этого петлю извлекают из пробирки, обжигают ее, края пробирок и пробки и, не туша пробок, вставляют их обратно в пробирки. Ставят засеянные среды в термостат. При пересеве на плотную среду (скошенный агар, свернутую сыворотку и пр.) – те же приемы, причем самый посев дела-* Рисунок 1. Платиновые петля, шпатель и прямая проволока, вставленные в иглодержатели. ется размазыванием штрихом (штриховые посевы) по поверхности среды; нужно при этом остерегаться, чтобы не нарушить целости среды. Пересевы с жидкой среды на жидкую можно делать также при помощи стерильной Пастеровской пипетки. Если пересеваемый материал очень плотен (туб. палочки, лучистые грибки), то удобнее вместо петли работать шпателем (рис. 1 и 2). Вт. н. «прямые» среды (агар, желатину) посев делается уколом (уколочный посев): материал захватывается на кончик платиновой иглы (рисунок 1), которую и вводят в среду (причем пробирку держат вверх дном), продвигая глубоко по оси пробирки. Для получения чистых культур из загрязненн. материала пользуются методом Рисунок 2. Шпатели Коцради-Дригальского. пластинчатых разводок на агаре или желатине в чашках Петри (или сосудах, построенных по тому же принципу, – большой гладкой поверхности для засева; рисунки Зи’4). Посев на чашки делается двояким образом: а) методом разливки по Коху и б) посевом на чашки с застывшим агаром. По способу Коха» – агар в пробирках растапливается в водяной бане или Коховском аппарате (см. Коха аппарат), охлаждается до 42 – 43°, и затем в ряд пробирок вносится путем постепенного разведения все меньшее количество исходного материала (напр. различные разведения его в бульоне или физиол. растворе), содержащего микробов. Засеянная т.о. среда в пробирках выливается в чашки Петри, причем края пробирок тщательно обжигаются перед выливанием среды.
Рисунок 3. Чашка Петри.
Чашки при этой процедуре стоят на ровной поверхности; левой рукой приподнимают крышку чашки с одной стороны, чтобы можно было подвести отверстие пробирки и вылить агар в чашку. Слегка наклоняя чашку в разные стороны, распределяют налитый в нее агар ровным слоем по всему дну ее. Когда агар затвердеет, чашки ставят в термостат вверх дном. Постепенное разведение засеваемого материала можно делать и в самом расплавленном агаре, засевая в первую пробирку материал и размешивая его в агаре, к-рый и переносят затем в количестве 1 – 2 петель в следующую пробирку. Таким же образом делают посевы на желатину, охлаждая ее до 30 – 37°. При уплотнении среды в чашках, в которые попало немного бактерий, они фиксируются далеко одна от другой, и каждая дает начало отдельной колонии [см. 'отд. табл. (ст. 83 - 84), рис. 6, 7 и 8]. Посев на чашки может быть сделан на застывшем в них агаре размазыванием материала по его поверхности. Для этого употребляют т. н. шпатели Конради-Дригальского, которыми, прокалив их предварительно на огне, захватывают посевной материал, затем снимают крышку с первой чашки и тщательно размазывают материал по поверхности среды, повертывая чашку кругом по плоскости. » Тем же шпателем, не захватывая нового материала, намазывают 2-ю, 3-ю, 4-ю и 5-ю чашки. Таким образом количество микробов на шпателе с каждой последовательной чашкой все уменьшается, в последние чашки их попадает очень мало, и в них вырастают отдельные колонии, тогда как в первых получается сплошной рост [см. отдельную таблицу (ст. 83 - 84), рис. 6, 7 и 8]. Вместо шпателя посев на чашки можно делать платиновой петлей, нанося последовательные штрихи одной и той же петлей на одной чашке (или же последовательно на ряде чашек), причем от последних вырастают отдельные колонии [см. отд. табл. (ст. 83 - 84), рисунок 9]. Пересевая колонии на среду в пробирки, получают чистую культуру микроба, с к-рой в дальнейшем и манипулируют. Самый вид колоний часто бывает характерным для данного микроба; поэтому колонии должны быть тщательно изучены. Для этих целей они рассматриваются в лупу, со слабыми системами микроскопа или в особому, н. пластинчатом микроско-п е (Plattenkulturmikroskop фирмы Цейса или Лейца; рис. 5), позволяющем наблюдение в падающем свете. С помощью этого же прибора делается пересев колонии путем т.н. гарпунированияее петлей.
Рисунок 4. Плоские колбы для пластинчатых разводок.
Рисунок 5. Пластинчатый микроскоп.
Для этих же целей пользуются особыми приборчиками, гарпунами, которые навертьшаются на тубус обычного микроскопа вместо центрированного объектива (рис. 6).
Рисунок 6. Объектив-гарпун.
При опускании тубуса игла (гарпун) погружается в колонию и захватывает микробов, которые и снимаются с нее в каплю жидкости на петле. Можно приготовить гарпун самому, налепив на пробку или еще лучше на старый объектив пластилин и укрепив в нем строго вертикально обыкновенную иглу. Во многих случаях, когда колонии крупны, можно производить пересев петлей под контролем невооруженного глаза.% Выделение чистых культур патогенных микробов с чашек является затруднительным, так как колонии некоторых патогенных и непатогенных микробов (например паратифозных бацил и кишечной палочки) бывают чрезвычайно сходны. В таких случаях большую помощь оказывают диференци-альные цветные среды (см. Питательные среди), которые тем или иным образом изменяют свой цвет в месте роста колоний некоторых бактерий. При обычной пластинчатой разводке колония может возникнуть из нескольких слипшихся экземпляров бактерий не одного вида. Поэтому при точной работе пользуются методом получения культур из одной клетки (Einzellenkultur). Для этой цели применим старый метод Бурри с тушью. Из новых методов необходимо указать на особый прибор микроманипулятор (см.) при помощи к-рого можно тоненькой пипеткой (рис. 7) выловить под контролем микроскопа отдельную бактерию и перенести ее на питательную среду.
. Рисунок 7. Микроманипулятор срыванием воздуха с пипеткой.
Если исходный материал очень» загрязнен посторонними микробами, то его предварительно, до засева очищают обработкой хим. агентами (к-ты, антифор-мин), промыванием в физиол. растворе (комки мокроты), нагреванием (спороносные виды). Если бактерий в материале мало, то прибегают к методам искусственного обогащения (высев палочек брюшного тифа из крови на желчь, холерного вибриона – из испражнений на пептон-ную воду) или элективного культивирования их (посев дифтерийных палочек на свернутую сыворотку, туб. бацил на лиловую среду Петрова и пр.). К методу обогащения должно быть отнесено и предварительное проведение через восприимчивое животное, в котором разовьются только патогенные микробы (например туберкулезные бацилы, пневмококки). Для культивирования анаэробов предложено много различных методов, основанных на создании условий выращивания микроба без доступа воздуха. Эти условия достигаются следующими путями или комбинацией их: а) удалением атмосферного воздуха (0 2 ), растворенного в питат. среде, путем кипячения ее с последующим ограничением вхождения воздуха снаружи при помощи соответствующей закупорки культуры; б) вытеснением растворенного в среде воздуха индиферент-ным для анаэробов газом; в) связыванием хим. веществами или физ. адсорпцией воздуха среды; г) высасыванием из герметически закрытого прибора с культурами и из их питательной среды при помощи воздушного насоса. Кипячение сред перед засевом («освежение» их) входит в постоянную технику культивирования анаэробов. Кипятятся среды, выдерживающие нагревание в Коховском аппарате; продолжительность кипячения пробирок – 10 мин., колб в 100 – • 200 см 3 – 20 минут, литровых колб – 60 минут. Пробирки могут быть прокипячены в водяной ванне в течение 15 мин. Затем следует быстрое охлаждение сред в снегу или холодной воде. Для уменьшения доступа воздуха применяют запаивание пробирок после засева (Weinberg, Vignal-Veillon), a также изолирование от воздуха жидких сред слоем жидкого парафина или вазелинового масла (стерильного). Для некоторых анаэробов достаточно бывает делать посев в т. наз. «высокие» среды (агар’ столбиком, Veillon), в глубокие слои которых доступ атмосферного кислорода ограничен. – Для выращивания анаэробов в бескислородной атмосфере большинство авторов пользуется водородом, образующимся в аппарате Киппа действием серной к-ты на металлический цинк. Водород перед поступлением в сосуд с культурами проходит для удаления остатков к-ты и 0 2 через промывные склянки с 10 %-ным раствором азотнокислого свинца и с щелочным раствором пирогаллола (аппаратNovy) (рис. 8).
Рисунок 8. Аппарат Novy для анаэробов.
Вместо Кипповского аппарата можно пользоваться бомбами со сгущенным водородом или азотом. Необходимо на выводной кран бомб наставлять предохранительный вентиль, уменьшающий большое давление, под к-рым газ выходит из бомбы. Для поглощения 0 2 в питательной среде прибавляют к ней редуцирующие вещества, напр. виноградный сахар (1 – 2%), муравьи-нокислый натрий и др. Адсорпция 0 2 достигается также прибавлением к среде кусочков живых органов (среда при этом наливается высоким слоем), богатых кроме того кат-лазой, к-рая разрушает перекиси, образующиеся в процессе роста анаэробов (печень, почки, мозг, кровь, кусочки куриного белка). Наиболее употребительные среды для анаэробов: печоночный бульон (Kitt-Tarozzi), молоко с кусочками печени, мозговая кашица, кровяной бульон, сахарный агар с кровью, бульон с кусочками куриного белка. На адсорбции 0 2 в среде животными и растительными тканями основан один из новейших методов культивирования анаэробов в обыкновенных закрытых ватными пробками пробирках – способ Врублевско-г о (рис. 9). В качестве адсорбента при этом методе на дно пробирки с жидкой средой (5 – 8 см г ) опускается кусочек ваты (0,1а). Стерилизация при 110° в течение */з часа.
Поглощение кислорода живыми клетками происходит в методе Фортнера (Fortner) – выращивание анаэробов на одной чашке с аэробами: чашка с кровяным агаром разделяется на две половины путем вырезывания и удаления полоски агара; на одной стороне делается посев Вас. prodigiosus, на другой – анаэроба; края чашки замазываются пластелином.
Одним из самых распространенных методов является также применение в качестве поглотителя O 2 свежего щелочного раствора пирогаллола (на 1 г пирогалловой к-ты берется обычно 1 см 5 10%-ного раствора «КОН). Свежеприготов- Рисунок 9. проленный раствор (обливание пирогалловой кислоты едким эробов. кали в самом приборе) наливается на дно прибора, в который помещаются пробирки (пробирка Бухнера, Оме-лянского) или чашки с разводками анаэробов [выращивание в эксикаторе, на дно которого налит раствор пирогаллола (Arens)]. Пирогаллол употребляется в комбинации с выкачиванием воздуха из прибора. Последнее производится при помощи водяного или масляного насоса. Водяной насос присоединяют к эксикатору с культурами (на дно налит пирогаллол), снабженному хорошим выводным краном.
Удаление воздуха из каждой засеянной пробирки применяется в технике по Вейнбергу. Высокие пробирки со средой после посева перетягиваются в верхней трети (над уровнем среды) на пламени горелки таким образом, чтобы в дальнейшем можно было легко их в этом месте запаять, затем через стеклянную трубку, вставленную в пробку, пробирки соединяются с водоструйным насосом (или масляным), и выкачивание воздуха происходит около пяти минут; когда среда в пробирке «закипит», легким обогреванием нижней части пробирки (газ пропускается через узкую трубку, металличе- скую или стеклянную, находящуюся в руке и соединенную с газовым краном резиновой трубкой) и постукиванием по ней помогают выходу воздуха из среды и запаивают пробирку в области перетяжки. Для выращивания анаэробов в чашках (пластинчатые разводки) Цейслером (Zeiss-ler) сконструирован прибор, выпускаемый фирмой Begerow (Altona) (рис. 10). Разрежение воздуха достигается при помощи масляного насоса Пфейфера до 1 мм (при пустом приборе) по ртутному манометру, присоединенному к прибору; при наполнении культурами разрежение прибора достигает 3 мм, часто только 5 мм .
Рпс. 10. Аппарат Begerow’a для выращивания анаэробов по Цейслеру.
Путем прокладки резинового кольца между крышкой и прибором достигается настолько прочное закрытие прибора, что наливание в него пирогаллола или других редуцирующих веществ является излишним. После выкачивания воздуха кран прибора закрывается, и последний ставится в термостат. – Для пересева культур анаэробов, а также выделения их в чистой культуре, пользуются особой техникой. Засев в жидкие среды (налитые высоким слоем) производится длинной капилярной пипеткой (просвет 5 – 6 мм). Засеваемый материал вносится в большом количестве в самые нижние слои среды. Засев в плотные среды (агар и желатину) производится или в предварительно расплавленные и остуженные (но не до пределов их застывания) среды той же капилярной пипеткой или же уколом длинной платиновой иглой до дна пробирки. Колонии в плотных средах развиваются в глубине среды и видны через стекло. Для пересева их делается надпил пробирки (предварительно обтертой спиртом) над колонией, пробирка разламывается, после чего колония извлекается петлей или слегка подогретой пипеткой и переносится лучше всего в печоночный бульон. Для посева на чашки материал размазывается на их поверхности платиновой петлей или шпателем Дригальского. Прямая перевивка колоний на чашку (особенно мелких) не всегда удается; поэтому лучше сначала перенести колонию вме- сте со средой в печоночный бульон, а после получения в нем роста сделать рассев на чашки.
При выделении анаэробов из смеси микробов пользуются нагреванием материала, последовательно при 80° в течение 20 мин.; при 100° – 5 мин., 20 мин., 30 мин., 40 мин., 60 мин., 180 мин., т. к. различные микробы и их споры погибают при этом в разное время, что и позволяет отделить их друг от друга. Дальнейшая диференцировка анаэробов ведется путем изучения характера их роста на средах, вида колоний, их биохим. свойств, морфологии, подвижности и опытов над животными. А. Тогунова.
Литература: см. лит. к ст. Бактериология, Микробиология и Протозоология.